Το Fluorescein isothiocyanate (FITC, «fit-c») είναι φωσφοριζόμαρκερ που δεσμεύεται χημικά (συζυγίζεται) σε μόρια (πρωτεΐνες, αντισώματα). FITC-labeled αντισώμα. Ενεργοποιείται στο 488 nm, απελευθερώνει φωσφορέσentzα στο 530 nm. Ανιχνεύεται με φωσφοριζόσκόπιο ή εξοπλισμό ανίχνευσης.
Μέθοδοι
- Βασικό πρωτόκολλο: FITC + αντισώμα σε αναλογία σε δοχείο, περιστροφή θερμοκρασίας δωματίου 1 ώρα. Αφαίρεση ανεσυγμένου FITC με affinity chromatography column (γυάλινη σωλήνα με γελ-ακτίνες που δέσμευει το FITC). Το FITC-labeled αντισώμα ρέει και συλλέγεται.
Παρατηρήσεις
- Πριν τον συζυγισμό: 1) FITC αστάθιστο, αποφύγετε φως (foil-covered tubes). 2) Χρόνος/θερμοκρασία μπορεί να αλλάξει για thermosensitive πρωτεΐνες. 3) Διαφορετικές ικανότητες δέσμευσης → βρείτε βέλτιστη αναλογία FITC/αντισώμα (πρόχειρες κλίμακες δοκιμές παράλληλα).
Χρήσεις
- Για assays/εφαρμογές: π.χ. στο κυττάρο μητρός στο αίμα (CD34). Μίξη αίματος με FITC-labeled αντισώμα anti-CD34, flow cytometer με laser → φωσφορέσentzα → διαχωρισμός CD34+ κυττάρων για θεραπευτικές χρήσεις.