Τύποι μικροσκοπίων φθορισμού

Όταν τα μικροσκόπια εφευρέθηκαν γύρω στο 1600 π.Χ., οι φυσικοί φιλόσοφοι γύρισαν τα μάτια τους σε έναν κόσμο μέσα σε έναν κόσμο. Όταν ο Antony van Leeuwenhoek δημιούργησε μικρούς, πολύ καμπύλους φακούς και μηχανικό κάτοχο για την προσαρμογή της όψης, άνοιξε ένα παράθυρο στον μικροσκοπικό κόσμο των βακτηρίων, των κυττάρων του αίματος, των πρωτόζωων και της κυτταρικής δομής των φυτών. Αλλά σε όλη την ιστορία της μικροσκοπίας, υπήρχε πάντα μια ερώτηση: Ποια είναι αυτά τα παράξενα πράγματα που φαίνονται μέσα από ένα φακό; Η μικροσκοπία φθορισμού αναφέρεται σε μια σειρά τεχνικών που ελαχιστοποιούν αυτήν την αβεβαιότητα - επειδή σε μικροσκοπία φθορισμού όταν το φως φωτίζεται σε ένα δείγμα, ανάβει το δικό του φως πίσω.

Epifluorescence

Μέχρι στιγμής το πιο συνηθισμένο μικροσκόπιο φθορισμού είναι η διάταξη επιφθορισμού. Σε ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού, μια φωτεινή πηγή - τυπικά ένας λαμπτήρας υδραργύρου ή ξένου - λάμπει μέσα από ένα φίλτρο που επιλέγει μια στενή περιοχή των μηκών κύματος. Το φιλτραρισμένο φως λάμπει στο δείγμα μέσω του αντικειμενικού φακού μικροσκοπίου. Το εισερχόμενο φως απορροφάται από φθοροφόρους - μοριακές ετικέτες που εκπέμπουν φως μεγάλου μήκους κύματος όταν απορροφούν φως μικρότερου μήκους κύματος. Το φως από τα φθοροφόρα, μαζί με το διάσπαρτο φως από την πηγή φωτισμού, επιστρέφει στον αντικειμενικό φακό και στον ανιχνευτή ή στο μάτι. Κατά μήκος του δρόμου, ένα άλλο φίλτρο αποκλείει το φως φωτισμού, οπότε το μόνο που απομένει είναι το φθορίζον φως από το δείγμα.

Confocal

Ένα μικροσκόπιο επιφθορισμού συλλέγει φως από παντού στο οπτικό πεδίο του μικροσκοπίου . Μερικά από τα φώτα διέγερσης απορροφώνται πριν από το εστιακό επίπεδο του μικροσκοπίου, μερικά στο εστιακό επίπεδο και μερικά από το εστιακό επίπεδο. Επειδή το μικροσκόπιο συγκεντρώνει όλο αυτό το φως, η εικόνα θα περιέχει μια έντονη εικόνα φωτός στην εστίαση, αλλά θα έχει επίσης φωτισμό εκτός εστίασης από άλλες περιοχές. Ένα ομοαξονικό μικροσκόπιο το καθορίζει εστιάζοντας σε ένα σημείο λέιζερ στο ίδιο επίπεδο με το μικροσκόπιο. Στη συνέχεια, μια οπή πηγαίνει μπροστά από τον ανιχνευτή, όπου αποκλείει όλο το φως που δεν προέρχεται από την εστίαση του μικροσκοπίου. Με τη σάρωση του δείγματος, μπορεί να ληφθεί μια καθαρή τρισδιάστατη εικόνα του αντικειμένου.

Multiphoton

Σε ένα ομοιοκαταληκτικό μικροσκόπιο η ευθυγράμμιση είναι πολύ ευαίσθητη. Εάν το σημείο λέιζερ, ο μικροσκοπικός φακός, τα οπτικά συλλέκτη και η μικροσκοπική οπή είναι απενεργοποιημένα ακόμη και στην παραμικρή ποσότητα που υποφέρει η απόδοση του μικροσκοπίου. Ένα μικροσκόπιο πολλαπλών τόνων παίρνει γύρω από αυτό το πρόβλημα χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος λέιζερ που είναι μόνο το μισό τόσο ενεργητικό όσο χρειάζεται για να διεγείρει τα φθοροφόρα στο δείγμα. Ο μόνος τρόπος με τον οποίο τα φθοροφόρα θα διεγερθούν και θα εκπέμπουν φθορισμό είναι αν το φως του λέιζερ είναι αρκετά φωτεινό ώστε δύο σωματίδια φωτονίων - φωτονίων να χτυπήσουν το φθοροφόρο σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Αυτό συμβαίνει μόνο όταν το λέιζερ είναι εστιασμένο σε ένα πολύ μικρό σημείο. Έτσι, το μόνο μέρος στο δείγμα που θα εκπέμπει φως είναι εκεί όπου το λέιζερ είναι συγκεντρωμένο, το οποίο κρατά την εικόνα ωραία και καθαρή γιατί δεν υπάρχει επιπλέον φως φόντου για να ξεφορτωθεί - πράγμα που σημαίνει ότι δεν υπάρχει καρφίτσα για να ευθυγραμμιστεί. Συνολικός φθορισμός εσωτερικής αντανάκλασης (TIRF)

Ένας άλλος τρόπος για να έχετε πολύ καθαρή εικόνα είναι να βεβαιωθείτε ότι το φως διέγερσης δεν φτάνει πολύ μακριά στο δείγμα. Αν για παράδειγμα, μια κηλίδα νευρώνων τοποθετηθεί σε μια σταγόνα διαλύματος σε μια γυάλινη ολίσθηση, τότε κάποιοι από τους νευρώνες θα προσκολληθούν στην επιφάνεια του γυαλιού. Σε ένα μικροσκόπιο εσωτερικής ανάκλασης φθορισμού (TIRF) το φως κατευθύνεται πλευρικά στη γυάλινη ολίσθηση, έτσι ώστε να μην το κάνει πραγματικά στη λύση που συγκρατεί τα κύτταρα. Αλλά μερικά από το φως μόλις μόλις διαρρέουν στη λύση - πολύ κοντά στην επιφάνεια του γυαλιού. Αυτό σημαίνει ότι τα μόνα σημεία που θα εκπέμπουν φως θα βρίσκονται σε μια πολύ λεπτή περιοχή ακριβώς πάνω στην επιφάνεια του γυαλιού. Για κάτι σαν νευρώνες, όπου συμβαίνουν τόσα ενδιαφέροντα πράγματα στην επιφάνεια των κυττάρων, αυτή η τεχνική μπορεί να είναι πολύ αποτελεσματική.

Υψηλή ανάλυση

Όλα τα μικροσκόπια - συμπεριλαμβανομένων των μικροσκοπίων φθορισμού - τη φυσική που διέπει τη διάδοση του φωτός. Ένας από τους βασικούς κανόνες είναι ότι ένα εστιασμένο σημείο φωτός μπορεί να γίνει τόσο μικρό - και όχι μικρότερο. Για το ορατό φως, αυτό το μέγεθος είναι περίπου 200 νανόμετρα ή 200 δισεκατομμύρια του μετρητή. Αλλά τα μόνα μόρια είναι μόνο μερικά νανόμετρα σε μέγεθος, έτσι υπάρχουν πολλά ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά που είναι κάτω από αυτό το όριο μεγέθους, που ονομάζεται όριο περίθλασης. Οι επιστήμονες αναπτύσσουν τεχνικές "υπέρ-ανάλυσης" για να γλιστρήσουν γύρω από αυτό το όριο. Για παράδειγμα, η μικροσκοπία δομημένης μικροσκοπίας φωτισμού (SIM) και η διεγερμένη μείωση της εκπομπής (STED) είναι μέθοδοι μικροσκοπίας φθορισμού που περιορίζουν το μέγεθος του σημείου εκπομπής φωτός με τη συρρίκνωση του μεγέθους του φωτεινού σημείου διέγερσης.